WB实验内参选择的原则

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Western Blot内参抗体种类很多，比如β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B等，那么针对自己的实验，我们该如何做选择呢?下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则： 

> 样本的种属来源

        选择内参抗体首先要考虑的是实验样本的来源。

1.     哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na/K ATPase等。

2.     植物来源实的验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。

3.     其他来源样本研究较少，所以研究者就需要参照文献报导，选择合适的抗体作为内参。

> 目的蛋白的分子量大小

        选择内参抗体时应该考虑目的蛋白分子量的大小，通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 kDa以上。比如目的蛋白分子量为45 kDa，此时不适宜选择β-actin（分子量为42 kDa）作为内参，可以考虑选择GAPDH(分子量为38 kDa)或者β-tubulin（分子量为55 kDa）作为内参。

> 目的蛋白的表达部位        一般实验主要是检测胞浆内的表达蛋白，选择β-actin、β-Tubulin、GAPDH的抗体就可以了；而对于核蛋白的定量，特别是样本来源于细胞核内蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值，常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用；对于膜蛋白检测，最常用的内参抗体为Na/K ATPase；对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

        以上几条原则只是针对通常情况，需要注意的问题是——内参的选择还需要考虑实际的实验环境，比如某些细胞由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达量增高，此时GAPDH就不适合做内参了；再比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化也不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案时应该综合考虑多方面因素并查询相关文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，可能是由于特殊原因导致，因而需要查阅相关文献并更换其他抗体作为内参。

MTT实验原理

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实验原理：

MTT细胞增殖及细胞毒性检测(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay )被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。

MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。

保存条件：

    4℃或-20℃保存，MTT需避光保存，一年有效；MTT配制成溶液后需-20℃避光保存；Formazan溶解液也可以室温保存。

实验步骤：

1. MTT溶液的配制：用5ml MTT溶剂溶解25mg MTT，配制成5mg/ml的MTT溶液。配制后即可使用，或直接 -20℃避光保存，也可以根据需要适当分装后-20℃避光保存。

2. 通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定)。按照实验需要，进行培养并给予0-10微升特定的药物刺激。

3. 每孔加入10微升MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4小时。

4. 每孔加入100微升Formanzan溶解液，在细胞培养箱内再继续孵育。直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。

5. 在570nm测定吸光度。如无570nm滤光片，可以使用560-600nm的滤光片。

注意事项：

由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

    MTT溶剂在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

    MTT配制成溶液后为黄色，需避光保存，长时间光照会导致失效。当颜色变为灰绿色时，请勿使用。MTT溶液在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。

本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

    用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

与其他实验的对比：