WB实验内参选择的原则

/在： /通过：

Western Blot内参抗体种类很多，比如β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B等，那么针对自己的实验，我们该如何做选择呢?下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则： 

> 样本的种属来源

        选择内参抗体首先要考虑的是实验样本的来源。

1.     哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na/K ATPase等。

2.     植物来源实的验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。

3.     其他来源样本研究较少，所以研究者就需要参照文献报导，选择合适的抗体作为内参。

> 目的蛋白的分子量大小

        选择内参抗体时应该考虑目的蛋白分子量的大小，通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 kDa以上。比如目的蛋白分子量为45 kDa，此时不适宜选择β-actin（分子量为42 kDa）作为内参，可以考虑选择GAPDH(分子量为38 kDa)或者β-tubulin（分子量为55 kDa）作为内参。

> 目的蛋白的表达部位        一般实验主要是检测胞浆内的表达蛋白，选择β-actin、β-Tubulin、GAPDH的抗体就可以了；而对于核蛋白的定量，特别是样本来源于细胞核内蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值，常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用；对于膜蛋白检测，最常用的内参抗体为Na/K ATPase；对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

        以上几条原则只是针对通常情况，需要注意的问题是——内参的选择还需要考虑实际的实验环境，比如某些细胞由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达量增高，此时GAPDH就不适合做内参了；再比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化也不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案时应该综合考虑多方面因素并查询相关文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，可能是由于特殊原因导致，因而需要查阅相关文献并更换其他抗体作为内参。