MTT实验原理

实验原理:

MTT细胞增殖及细胞毒性检测(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay )被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。

MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。在特定溶剂存在的情况下,可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快,则吸光度越高;细胞毒性越大,则吸光度越低。

保存条件:

    4℃或-20℃保存,MTT需避光保存,一年有效;MTT配制成溶液后需-20℃避光保存;Formazan溶解液也可以室温保存。

实验步骤:

1. MTT溶液的配制:用5ml MTT溶剂溶解25mg MTT,配制成5mg/ml的MTT溶液。配制后即可使用,或直接 -20℃避光保存,也可以根据需要适当分装后-20℃避光保存。

2. 通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100微升5000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。按照实验需要,进行培养并给予0-10微升特定的药物刺激。

3. 每孔加入10微升MTT溶液,在细胞培养箱内继续孵育4小时。

4. 每孔加入100微升Formanzan溶解液,在细胞培养箱内再继续孵育。直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解。通常37℃孵育4小时左右,紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少,溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多,溶解的时间会长一些。

5. 在570nm测定吸光度。如无570nm滤光片,可以使用560-600nm的滤光片。

注意事项:

由于使用96孔板进行检测,如果细胞培养时间较长,一定要注意蒸发的问题。一方面,由于96孔板周围一圈最容易蒸发,可以采取弃用周围一圈的办法,改加PBS,水或培养液;另一方面,可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方,以缓解蒸发。

    MTT溶剂在低温情况下会凝固,使用前请室温放置或20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

    MTT配制成溶液后为黄色,需避光保存,长时间光照会导致失效。当颜色变为灰绿色时,请勿使用。MTT溶液在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固,可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解,并且必须在全部溶解并混匀后使用。

本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。

    用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,否则会干扰测定。

与其他实验的对比: